Jegyzetek medikusoknak/Mikrobiológia/Általános virológia/A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája

A Wikikönyvekből, a szabad elektronikus könyvtárból.
Ugrás a navigációhoz Ugrás a kereséshez


Vizsgálati anyagok vétele és beküldése[szerkesztés]

Mintavétel[szerkesztés]

  • lokális fertőzés esetén az elváltozás helyéről kell venni
  • szervi vagy szisztémás fertőzés esetén a test különböző helyeiről kell mintát venni
  • enteralis fertőzések kimutatása a székletből lehetséges
  • biopszia vétele szükséges lehet:
    • vírusos encephalitisben, ha azt arbo- vagy robovírus okozza
      • ezek nem jelennek meg a liquorban
    • tisztázatlan etiológiájú perzisztens fertőzésekben
    • immunszuppresszáltakban vírusos pneumonia esetén alveolaris mosófolyadékot célszerű beküldeni

Tárolás és szállítás[szerkesztés]

  • virális transzportközegeket kell használni, ezek tartalmaznak:
    • fehérjét
    • neutrális pH-jú puffert
    • antibiotikumokat és antifungális szereket
  • 4 °C-on 24 óráig tarthatók el a minták biztoságosan
  • az olvasztás és a fagyasztás kerülendő, egyes vírusokat inaktivál
    • hosszú távú tárolás -70 °C-on lehetséges

Feldolgozás[szerkesztés]

  • a baktériummentes minták közvetlenül leolthatók
  • kontaminált mintákat antibiotikummal, éterrel vagy baktériumszűrővel lehet kezelni
  • a szöveti minták kezelése tripszines szeparálással kezdődik, ezután:
    • közvetlen tenyésztés
    • kokultiváció fogékony sejtekkel

Vírusok tenyésztése[szerkesztés]

Állatoltás[szerkesztés]

  • főleg történeti jelentősége van
    • az influenzát vadászgörényben,
    • a poliovírust majomban sikerült izolálni
  • problémák:
    • nehéz fogékony állatot találni
    • általában nem specifikusak a tünetek
    • a kísérleti állatban jelen lehet látens fertőzés
  • ma is használják a coxsackie A és B csoport elkülönítésére
    • a vírust szopós egerekbe oltják
    • az A csoport petyhüdt bénulást okoz (izomnecrosist)
    • a B csoport spasticus bénulást (encephalitist)

Embrionált tojás[szerkesztés]

  • 7-12 napos, embrionált tojást használnak
    • ebben sokfajta, de nem minden emberi vírus szaporítható
    • a csirkeembrió immunológiailag inaktív
  • az egyes vírusok ideális oltási helye eltérő lehet:
    • chorioallantois-membránra oltják a poxvírusokat és a herpesvírusokat
      • a fertőzött membránon szürkésfehér csomócskák, pock-ok jelennek meg
    • amnionba oltják az influenzavírusokat és a mumpsvírust
      • ezek allantoisban is szaporíthatók a tojáshoz való adaptálás után
  • az embrionált tojás igen fogékony az influenza A iránt
    • főleg a vakcinák előállításához szükséges vírus előállításához használják

Sejtkultúrák[szerkesztés]

  • primer tenyészetek
    • állati szervekből vagy emberi embriókból készítik
    • a feldarabolt szövetdarabot tripszinnel emésztik, majd a sejteket tápoldatba helyezik
    • a sejteknek ugyanazok a tulajdonságai, mint az intakt sejtnek
    • perifériás vérből kialakított mononukleáris sejtkultúrán szaporítják a HIV-et
  • diploid sejtvonalak
    • 50-60 cikluson át passzálhatók, ezután csökken a szaporodóképesség, és a tenyészet kihal
    • az eredeti karyotípus megmarad
    • kialakíthatók:
      • embrionális tüdőből
      • bőrből
      • tonsillából
  • folyamatos sejtvonalak
    • immortalizált sejtvonalak, korlátlanul passzálhatók
    • eretük lehet:
      • embrionális
      • felnőtt
      • tumoros
    • a kromoszómaszám változó, heteroploid sejtvonalak
    • gyakran használt sejtvonalak:
      • majom-veseszövetből: Vero, BSC-1
      • emberi méhnyakrákból: HeLa
      • emberi gégerákból: HEp-2
      • emberi T-sejtes leukaemia- vagy lymphoma-eredetű sejtvonalakban is tenyésztenek HIV-et

Vírusok kimutatása[szerkesztés]

Kimutatás tenyészetekben[szerkesztés]

Natív mikroszkópos vizsgálattal[szerkesztés]

  • destrukció
    • a sejtek lekerekedésével kezdődik
    • ezután változik meg a sejtek fénytörése
    • végül a sejtek leválnak a tenyésztőedény faláról és elpusztulnak
  • syncytium-képződés
    • főleg a paramyxovírusokra és a CMV-re jellemző
  • transzformáció
    • polyomavírussal vagy sarcomavírussal fertőzött állati sejtvonalakban jelentkezik
    • a rutin diagnosztikának nem része

Festett készítmény mikroszkópos vizsgálatával[szerkesztés]

  • ilyenek a zárványok
    • alkothatják:
      • a vírus struktúrfehérjéi
      • a sejt fertőzés miatt keletkezett kóros anyagcsere-termékei
    • elhelyezkedhet:
      • a citoplazmában:
        • paramyxovírusok
        • poxvírusok
        • reovírusok
        • rhabdovírusok
      • a magban:
      • egyidejűleg a magban és a citoplazmában:
        • morbilli
        • CMV

Indirekt kimutatási lehetőségek[szerkesztés]

  • hemagglutináció
    • úgy alakul ki, hogy a vírusok hidakat képeznek a VVT-ken lévő receptorokhoz való kötődéssel
    • pozitív esetben a VVT-k nem ülepszenek le
    • így mutathatók ki az influenzavírusok az embrionált tojásból
  • hemadszorpció
    • ha a vírusnak van hemagglutininje, akkor ez a fertőzött sejtek felszínén is megjelenik
    • ezek a sejtek bizonyos fajú VVT-ket megkötnek
    • így mutathatók ki az orthomyxovírusok és paramyxovírusok
  • vírusspecifikus antigének
    • detektálásuk IF, RIA vagy ELISA módszerrel történik
  • vírusinterferencia
    • azt használják ki, hogy egy sejt fertőzése egy nem citopátiás vírussal megakadályozhatja bizonyos másik vírussal való fertőződést
    • a rubeola kimutatására használják:
      • ez primer majomvese-kultúrában jól szaporodik, citopátiás hatása nincs
      • az echovírusok rövid idő alatt elpusztítják ezeket
      • ha a mintában rubeolavírus volt jelen, akkor a vele kezelt sejteken az echovírusnak nincs citopátiás hatása

Gyors diagnosztikai módszerek[szerkesztés]

Fénymikroszkópos módszerek[szerkesztés]

  • rutinszerűen alkalmazott, olcsó eljárások
  • HSV vagy VZV kimutatása
    • a vesiculumok basalis részéről vett kaparékot festik Giemsával, ez a Tzank-kenet
    • duzzadt magvú óriássejtek utalnak a fertőzésre
  • kanyaró kimutatása
    • ekkor a Koplik-folt jelenléte utal a kanyaróra
  • CMV kimutatása a cytomegaliás sejtek jellemzőinek azonosításával történik:
    • keskeny cytoplazmaszegély
    • nagy mag
    • benne halvány udvarra övezett basophil zárványtest
  • veszettség kimutatása
    • az idegsejtekben kerek vagy ovális eosinophil zárványtestek vannak
    • bennük basophil foltok

Elektronmikroszkópia[szerkesztés]

  • nagyon költséges és nem túl érzékeny módszer
  • az astrovírusok esetében használják, ahol nincs más diagnosztikus lehetőség

Sejtekben lévő antigén kimutatása[szerkesztés]

  • immunfluoreszcens módszer (IF)
    • herpesvírusok és számos felső légúti vírusfertőzés kimutatására alkalmas
    • a kaparékból centrifugálással nyerik ki a sejteket, majd tárgylemezre fixálják
    • ezután direkt vagy indirekt IF-fel mutatják ki az antigéneket
  • immunperoxidáz módszer (IP)
    • jól használható a CMV kimutatására leukocytákban
    • ezzel kimutatható a HSV encephalitisben és a rabiesvírus is

Extracelluláris antigének kimutatása[szerkesztés]

  • szilárd fázisú immunassay
    • a szilárd fázishoz vannak kötve az antitestek
    • ilyen az ELISA
    • kimutatható vírusok:
      • HBV
      • rotavírus
      • enteralis adenovírusok
      • respiratory syncytial virus
      • HIV
      • HSV

A vírus-nukleinsav kimutatása[szerkesztés]

  • régebben hibridizációt, ma PCR-t használnak
    • a PCR igen kis mennyiségű vírust is ki tud mutatni
    • emiatt alkalmas HSV-encephalitis és HIV kimutatására
    • szintén hasznos olyan esetben, amikor a vírus sejttenyészetben nem szaporítható, ilyenek:
      • HCV
      • parvovírus B19

Szerológiai módszerek[szerkesztés]

Az immunglobulinok jelentősége[szerkesztés]

  • IgM jelenléte primer vírusfertőzést jelez
  • IgG jelen van primer és korábbi fertőzésben is
  • titerük pontos megállapítása merkaptánokkal lehetséges

Vírusneutralizációs próba[szerkesztés]

  • a gyakorlati alkalmazás limitált
    • egy vizsgálathoz sok állatra, embrionált tojásra vagy sejtre van szükség
  • vírusvakcinák hatékonyságának mérésére is használják

Complementkötési reakció[szerkesztés]

  • nem típus, hanem csoportspecifikus próba
  • előnye, hogy a komplementkötő ellenanyagok hamarabb megjelennek, mint a neutralizálók
  • munkaigényessége miatt visszaszorulóban van az alkalmazása

Hemagglutináció-gátlás[szerkesztés]

  • ha a hemagglutinin egyben a fertőzőképességért felel, a neutralizációs próbával azonos eredményt ad

Hemadszorpció-gátlás[szerkesztés]

  • olyan vírusokra használható, amiknek nincs, vagy csekély a cytopathiás hatása

Immunfluoreszcencia[szerkesztés]

  • a tárgylemezre fertőzött sejteket fixálnak
  • ezekhez kötődnek a beteg ellenanyagai, ha vannak
  • ezeket jelzett, monoklonális anti-humán-immunglobulinokkal mutatják ki

Enzimimmunoassay[szerkesztés]

  • a kimutatás pontosságát akadályozzák az esetlegesen jelen lévő rheumafaktor anti-IgG IgM-ek
  • ezt a reverz ELISA módszer kifejlesztésével oldották meg
    • itt a szilárd fázisra eleve anti-IgM ellenanyag van kötve
    • a jelzett antitest nem a humán Ig-re, hanem a vírusantigénre specifikus
    • így az IgM titer megmérhető anélkül, hogy a specifikus IgG-k az RF-en keresztül meghamisítanák az eredményt